急性白血病的微小残留病

急性白血病是严重危害人类健康的重大疾病之一，AL患者初诊时体内白血病细胞可以达到10¹²个（相当于数磅重量的实体肿瘤），获得临床CR是AL患者通往长期无病生存（LFS）道路上的早期、重要、必须一个关键环节，但取得CR并不意味着能达到LFS，因为患者在血液学CR状态时体内仍剩余10¹⁰个左右的白血病细胞（相当于2立方厘米的实体肿瘤）。

达到血液学缓解白血病MRD检测的目的包括：
①确定治疗能否清除白血病细胞或是否仍有残留白血病细胞。
②比较不同治疗方法的疗效。
③评估缓解状态及是否复发。
④为治疗方案选择提供依据，即危险分层指导的治疗。

20世纪80年代，细胞遗传学技术以及流式细胞（FCM）术被用于AL患者的MRD检测，但敏感性较低；90年代，免疫荧光原位杂交技术及分子生物学（聚合酶链反应，简称PCR）技术的引入，使MRD检测的敏感性进一步提高。21世纪的前十年，随着多参数FCM和PCR技术的完善以及二代测序技术（NGS）、全基因组测序技术和质谱流式技术的兴起，白血病MRD检测不仅能够发现新的治疗靶点，而且将实现个体化的MRD检测。

检测方法

由于缺乏通用的确定白血病细胞的生物学标记，因此区分白血病细胞和正常造血干/祖细胞是所有MRD检测技术面临的挑战。以下重点讨论常用的多参数流式细胞术（MFC）以及实时定量聚合酶链式反应（Real-time quantitative PCR，简称qPCR）。

MFC检测
MFC检测AL患者MRD的基本原则基于两种方法。其一是利用白血病细胞表面表达、正常祖细胞表面表达缺乏的抗原组合来确定白血病相关免疫表型（LAIP）；初诊时，抗体组合确定白血病细胞而非正常祖细胞所在的区域，治疗后出现在相应区域的白血病细胞即为MRD；该方法确定MRD包括抗原表达不同步、跨系抗原表达、抗原表达增强或减弱以及异常光散射等，其缺点是：
①由于白血病细胞的异质性以及治疗的影响，白血病细胞的表型会发生变化（又称抗原漂移），初诊和复发患者至少1种白血病抗原的变化的发生率为88%～91%，抗原漂移导致MRD检测出现假阴性。
②与白血病细胞类似，正常造血祖细胞在化疗或造血干细胞移植后表型也可发生变化，出现在LAIP区域，导致MRD检测的假阳性。
③该方法完全依赖于知晓初诊时的表型，如果没有初诊时的表型，LAIP检测就无从谈起。
另一种方法通过认知正常造血细胞的免疫表型来确定白血病细胞，该方法避免了LAIP方法由于免疫表型漂移所致的MRD检测局限性，可在不知晓初诊表型的情况下进行MRD检测，同时有助于实现MRD检测的标准化；其不足之处在于要求检测专家对于正常造血细胞的抗原表达十分了解。MFC检测的敏感性取决于白血病细胞的表型漂移程度、具有与白血病细胞类似的正常祖细胞数量以及检测时获取的有核细胞数量，可达到0.01%～0.001%。

qPCR检测
qPCR技术的发展为AL患者MRD检测的标准化提供了基础，但是基于PCR技术的MRD检测只适用于40%～70%的急性髓细胞白血病（AML）和≥90%的急性淋巴细胞白血病（ALL）患者。AML患者的MRD靶点包括融合基因PML-RARA、RUNX1-RUNXT1、CBFB-MYH11及MLL等，这些基因在年轻AML患者中占25%左右；在不存在融合基因的AML患者中，NPM1、FLT3及CEBPA突变的发生率为60%～70%左右。ALL患者中50%以上患者存在免疫球蛋白重链（IgH）和TCRG的基因重排，联合其他PCR检测的靶基因，90%～95%的ALL患者可借助PCR技术进行MRD检测，敏感性可以达到0.01%～0.001%。

分子学新技术
数字PCR技术使得MRD检测敏感性较传统PCR技术提高近10倍，该技术的优势在于无须参考物就能得出核酸的绝对定量、对PCR抑制剂有很好地耐受性，提高了扩增效率。在慢性粒细胞白血病患者MRD监测时，数字PCR可能优于RT-qPCR，但其在急性白血病监测中的优势还需要更多的研究证实。

NGS被证实在白血病诊断方面的潜在优势，并逐步被用于MRD检测。NGS被用于T-和B-ALL MRD监测主要赖于其高通量能力，可同时扩增IgH或TCR位点的几乎所有组合，使该技术几乎可以用于所有ALL患者的MRD检测。在AML，NGS检测NPM1突变的可行性已经得到证实，NGS检测NPM1的敏感性可以达到0.001%，与qPCR相当。

检测与临床预后

研究证实不仅诱导CR后的MRD，而且巩固后、造血干细胞移植（allo-SCT）前后的MRD都与临床预后密切相关，上述结果不仅在ALL，而且在AML患者中都得到了证实，提示不同时间点检测AL患者MRD可能用于危险分层指导的干预和/或治疗。

ALL患者中MRD的预后意义
1998年，半定量PCR被用于ALL患者的Igƙ和TCR基因检测，结果显示无论早期高水平的MRD（≥10-2）还是晚期低水平的MRD（≤10-4）均提示预后不良。利用qPCR和MFC检测ALL患者诱导治疗后的MRD同样能很好地预测化疗后的DFS和总体生存（OS），诱导后29天这个时间点检测骨髓MRD最具预后意义；高危ALL患者巩固治疗后MFC检测到的MRD也具有预后意义，大于10-4的患者预后极差。MRD检测不仅与单纯化疗患者的预后相关，而且与造血干细胞患者的预后密切相关。

在B-ALL患者中，以治疗后29天MRD≥10-3为阈值，MFC和qPCR检测的效率相当；对于T-ALL患者而言，qPCR检测第29天MRD的复发预测意义优于MFC。MRD在B-ALL患者中具有相当强的独立预后意义，无论在什么时间点，采用何种MRD检测方法，这提示MRD是一种可靠标记。对于T-ALL患者而言，MRD临床阈值的界定与检测方法、检测的时间点以及治疗方法都密切相关，因此，T-ALL临床MRD阈值界定时应考虑是否是同一个临床试验，不同临床试验之间不能直接比较。

AML患者中MRD的预后意义
除了白血病特异基因RUNX1-RUNX1T1、NPM1、CBFB-MYH11和MLL融合转录子以外，泛白血病基因WT1也被用于AML患者MRD检测。诱导化疗后WT1下降＜2log的患者和≥2log的患者5年累计复发率分别为75%和40%。造血干细胞移植后WT1高表达是独立的预后不良因素。MFC检测AML患者的MRD不仅能够用于化疗后，而且还可以用于移植前、移植后的预后预测。造血干细胞移植后MFC检测MRD水平＜0.1%患者，其复发率也显著增高，OS显著降低21，MFC和qPCR检测WT1在MRD具有很好的一致性，WT1与MFC联合检测MRD能提高移植患者预后预测的敏感性，不影响特异性。

与ALL患者中观察到的结果类似，AML患者MRD检测的阈值和时间点在不同亚组患者中变化较大，这可能与不同AML人群中分子生物学差异以及他们对治疗的反应率和程度不同所致。RT-qPCR已经证实AML患者的白血病融合转录子不同、复发动力学也存在显著差别，这提示不同的遗传类型其MRD检测的时间点间隔也应各异。尽管AML患者的白血病细胞存在较大的异质性，但诱导缓解后白血病细胞清除仍与高LFS和OS密切相关。

MRD在危险分层指导的治疗中的作用

现有资料证实借助MRD进行危险分层指导的治疗可改善复发高危ALL患者的预后；基于MRD的更强力的治疗（包括Allo-SCT）确实能降低成人和儿童ALL患者的复发率、提高LFS和OS。MRD指导的t（8；21）AML患者分层治疗也表明Allo-SCT可以显著改善复发高危组（巩固治疗2疗程后形态学CR，但MRD阳性）的预后，但复发低危组（巩固治疗2疗程后形态学CR，但MRD阴性）患者并未因接受移植而受益。系列研究证实了MRD在ALL和AML患者危险分层中的重要作用，提示基于MRD分层指导的干预可显著改善高危复发患者的预后，且使复发低危患者避免接受不必要的强烈治疗。

MRD检测的临床实践与前景

MRD不仅能用于早期治疗反应的评估、治疗后复发的监测，而且为AL患者和预后预测和危险分层指导的治疗提供了重要的生物学标记；MRD的合适检测方法取决于AL的生物学特性及临床场景；MRD检测的时间和敏感性与治疗方法及治疗反应率密切相关。AL患者的MRD检测还存在如下问题：
①如何解决MRD检测存在的假阴性和假阳性。
②如何实现具有不同复发动力学的不同类型AL患者MRD检测的个体化。
③如何利用MRD检测来评估AL患者的残存肿瘤符合。
④如何基于现有的MFC、qPCR等评估手段建立MRD通用评估策略。