将荧光素钠经手臂静脉快速注入体内后，用蓝光照射眼底，眼内血液循环中的荧光素被激发产生黄绿色荧光，用眼底照相机观察和采集图像，从而反映活体眼底病变情况的眼科检查。自20世纪60年代应用于临床。
荧光素钠分子量仅376道尔顿，虽不能通过视网膜毛细血管内皮细胞的紧密连接（血视网膜屏障，或称视网膜内屏障）和视网膜色素上皮细胞的紧密连接（视网膜外屏障），但能自由通过有窗孔的脉络膜毛细血管。因此正常情况下荧光素在视网膜色素上皮后脉络膜组织内形成弥漫的背景荧光，以及视网膜和脉络膜血管内荧光。
病理情况下眼底出现的异常荧光可以是荧光减弱（弱荧光，或称低荧光）或增强（强荧光，或称高荧光）以及异常血管荧光等。弱荧光包括遮蔽荧光（由于组织或液体的遮挡使正常荧光看不到或模糊不清）、充盈迟缓或缺损（视网膜和/或脉络膜的血液循环发生障碍，使血管或其供应的区域荧光充盈迟缓，甚至缺如）。强荧光包括透见荧光（视网膜色素上皮脱色素使得深部脉络膜的背景荧光增强，又称窗样缺损）和渗漏（视网膜内、外屏障的紧密连接破坏使荧光素钠漏出造成血管壁或周围组织染色或染料积存），同时还需排除自发荧光和假荧光。
眼底荧光血管造影可清晰显示眼底特别是视网膜的异常血管及其功能状态，如血管迂曲、血管扩张和管壁瘤、血管狭窄、视网膜内微血管异常、视网膜和视盘新生血管、侧支和短路等异常循环、血管瘤、视网膜血管瘤样增生、视网膜血管增生性肿瘤、脉络膜新生血管等。
眼底荧光血管造影检查一般比较安全。部分人有一过性恶心，甚至呕吐，检查后全身皮肤黏膜黄染，通常1～2天后消失。需警惕可能存在严重的过敏反应。